激光共聚焦顯微鏡是一種先進(jìn)的細胞和分子生物學(xué)分析儀器，已被激光，電子照相機和計算機圖像處理等現代高科技手段所滲透，并與傳統的光學(xué)顯微鏡相結合。它以激光為光源，采用共軛聚焦原理和裝置，并使用計算機對觀(guān)察對象進(jìn)行數字圖像處理觀(guān)察，分析和輸出。它的特征是對樣品進(jìn)行斷層掃描和成像，對細胞的三維結構進(jìn)行非侵入式觀(guān)察和分析。同時(shí)，使用免疫熒光標記和離子熒光標記探針，該技術(shù)不僅可以觀(guān)察固定的細胞和組織切片，還可以實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀(guān)察和檢測活細胞的結構，分子，離子和生命活動(dòng)。它越來(lái)越多地用于生物學(xué)和醫學(xué)領(lǐng)域，已經(jīng)成為生物醫學(xué)實(shí)驗研究中重要的工具。
激光共聚焦顯微鏡也是活細胞的動(dòng)態(tài)觀(guān)察、多重免疫熒光標記和離子熒光標記觀(guān)察的有力工具。不僅可對活的或固定的細胞及組織進(jìn)行無(wú)損傷的“光學(xué)切片”，進(jìn)行單標記或雙標記細胞及組織標本的熒光定性定量分析；還可以用于活細胞生理信號，離子含量的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)分析監測，粘附細胞的分選，細胞激光顯微外科和光陷阱技術(shù)等?？梢詿o(wú)損傷的觀(guān)察和分析細胞的三維空間結構。
激光共聚焦顯微鏡的原理是用點(diǎn)光源照射試樣，在焦平面上形成輪廓清晰的小光斑。光斑照射后發(fā)出的熒光被物鏡收集，沿原照射光路送回由雙向色鏡組成的分光鏡。光譜儀將熒光直接發(fā)送到檢測器。光源和探測器前面有一個(gè)針孔，分別稱(chēng)為照明針孔和檢測針孔。兩者的幾何尺寸相同，約100-200納米；與焦平面上的光斑相比，兩者是共軛的，即光斑可以通過(guò)一系列透鏡同時(shí)聚焦在照明針孔和檢測針孔上。這樣，來(lái)自焦平面的光可以會(huì )聚在檢測孔范圍內，而來(lái)自焦平面上方或下方的散射光被阻擋在檢測孔之外而無(wú)法成像。激光逐點(diǎn)掃描樣本，檢測到針孔后的光電倍增管也逐點(diǎn)獲得相應光點(diǎn)的共焦圖像，將其轉化為數字信號傳輸至計算機。整個(gè)焦平面的清晰共焦圖像聚集在屏幕上。
每個(gè)焦平面圖像實(shí)際上是樣品的光學(xué)橫截面，這種光學(xué)截面總是具有一定的厚度，也稱(chēng)為光學(xué)片。由于焦點(diǎn)處的光強遠大于非焦點(diǎn)處的光強，且非焦平面光被針孔過(guò)濾，因此共焦系統的景深近似為零。沿z軸掃描可實(shí)現光學(xué)斷層掃描，并在待觀(guān)察樣品的焦斑處形成二維光學(xué)切片。將X-Y平面（焦平面）掃描與z軸（光軸）掃描相結合，將連續層次的二維圖像進(jìn)行累加，經(jīng)專(zhuān)用計算機軟件處理，即可得到樣品的三維圖像。即檢測針孔和光源針孔始終聚焦在同一點(diǎn)上，使得聚焦平面外激發(fā)的熒光無(wú)法進(jìn)入檢測針孔。
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