激光共聚焦顯微鏡的基本觀(guān)察步驟

　　激光共聚焦顯微鏡是一種高分辨率的顯微成像技術(shù)。普通的熒光光學(xué)顯微鏡在對較厚的標本(例如細胞)進(jìn)行觀(guān)察時(shí)，來(lái)自觀(guān)察點(diǎn)鄰近區域的熒光會(huì )對結構的分辨率形成較大的干擾。共聚焦顯微技術(shù)的關(guān)鍵點(diǎn)在于，每次只對空間上的一個(gè)點(diǎn)(焦點(diǎn))進(jìn)行成像，再通過(guò)計算機控制的一點(diǎn)一點(diǎn)的掃描形成標本的二維或者三維圖象。在此過(guò)程中，來(lái)自焦點(diǎn)以外的光信號不會(huì )對圖像形成干擾，從而大大提高了顯微圖象的清晰度和細節分辨能力。
 

　　樣品制備是檢測前的關(guān)鍵步驟，樣品需要用熒光探針(單，雙和三)標記。標本可以是固定的或活組織，或固定或活的貼壁培養。細胞應在共聚焦特殊培養皿或蓋玻片，懸浮細胞，萼片或滴劑和蓋玻片上培養，覆蓋。樣品厚度約1~2mm，蓋玻片厚度應小于0.17mm，滑塊厚度應在0.8~1.2mm之間，表面光滑，厚度均勻，并且沒(méi)有明顯的干擾熒光。固定樣品通常用密封片密封，通常使用通過(guò)使用pH 8.5-9的PBS制備的甘油密封。
 

　　根據實(shí)驗要求制備樣品完畢后。即可進(jìn)行觀(guān)察，基本步驟如下：
 

　　(1)開(kāi)啟儀器電源及光源：一般先開(kāi)啟激光共聚焦顯微鏡和激光器，再啟動(dòng)計算機，然后啟動(dòng)操作軟件，設置熒光樣品的激發(fā)光波長(cháng)，選擇相應的濾光鏡組塊。以便光電倍增管檢測器能得到足夠的信號結果。
 

　　(2)設置相應的掃描方式：在目視模式下.調整所用物鏡放大倍數，在顯微鏡下找到需要檢測的細胞。切換到掃描模式，調整雙孔針和激光強度參數，即可得到清晰的共聚焦圖像。
 

　　(3)獲取圖像：選擇合適的圖像分辨率，將樣品完整掃描后，保存圖像結果即可。
 

　　(4)關(guān)閉儀器：儀器測定樣品結束后，先關(guān)閉激光器部分，計算機仍可繼續進(jìn)行圖像和數據處理。若要退出整個(gè)激光掃描共聚焦顯微鏡系統，則應該在激光器關(guān)閉后，待其冷卻至少10分鐘后再關(guān)閉計算機及總開(kāi)關(guān)。